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Publikation

tl_files/kuhner/product/safety/Bilder/pdf.jpg Fed-Batch Mode in Shake Flasks by Slow-Release Technique (Biotechnology and Bioengineering, 10/2006)

FeedBeads/Tubes/Plates

Produkt

Slow Release Technologie

Kurzbeschreibung

Slow Release Discs (FeedBeads) sind Polymerpartikel aus in Silikonmatrix eingebundener Glukose, die mit einer definierten Kinetik freigesetzt wird.

Leistungsmerkmale

 
+ Erhöht die Screening-Sicherheit
+ Geeignet zum Hochdurchsatz-Screening (HTS)
+ Einfache Anwendung
+ Keine zusätzlichen Geräte wie Pumpen, Schläuche etc. notwendig
+ Kein Einsatz von zusätzlichen Enzymen

Fed-batch Betrieb

FeedBeads ermöglichen den fed-batch Betrieb in handelsüblichen Schüttelkolben, Reagenzgläsern und Mikrotiterplatten ohne zusätzliche Installationen wie Pumpen oder Schläuche.

Über 90% der Produktionsprozesse werden in fed-batch Fahrweise geführt. Mit FeedBeads lässt sich schon das Screening von geeigneten Stämmen im fed-batch Modus und unter substratlimitierten Bedingungen durchführen.

Problemloses Scale-up

Durch den Einsatz von FeedBeads werden somit wesentliche Nachteile der meisten (batch-) Screeningansätze (z.B. Crabtree-Effekt, Überflussmetabolismus, ...) vermieden, optimale Produktionsstämme werden schneller identifiziert und das Scale-up verläuft reibungslos.

Technische Daten

Slow Release Technologie

Produktinformation

   
Grössen

Für weitere Informationen
Substrat

Glukose
Optionen

Auf Anfrage sind auch andere kristalline Nährstoffe als limitierendes Substrat erhältlich.

Anwendungsbereiche

Slow Release Technologie

Kontrollierte Glukosefreisetzung durch slow-release Technology

Ohne apparativen Aufwand oder Einsatz von Enzymen lassen sich mit FeedBeads im Schüttelkolben substratlimitierte Bedingungen wie beim fed-batch-Modus herstellen. tl_files/kuhner/product/shaker/add-ons/Freigesetzte_Glukose_499.png

Abb. 1: Freigesetzte Menge Glukose [mg] bei Zugabe der angegebenen Zahl FeedBeads (FB, 12 mm Durchmesser, Art.-Nr. SMFB63319) pro Ansatz im 250 mL Schüttelkolben mit je 25 mL 0,1 M Phosphatpuffer; Temperatur 37 °C, Drehzahl 280 rpm, Schütteldurchmesser 50 mm, pH 7.

 

 

Die in Silikon-Elastomer eingebundene kristalline Glukose werden mit einer definierten Kinetik freigesetzt. Die Glukosemenge pro Ansatz lässt sich durch Zugabe mehrerer FeedBeads einfach steigern, die Beads beeinflussen sich untereinander nicht.

Hansenula polymorpha: Screening unter substratlimitierten Bedingungen

Die Hefe Hansenula polymorpha ist als Organismus zur Produktion von Proteinen gut untersucht. Als Reporterprotein in Hansenula wird häufig das grün fluoreszierende Protein (GFP) unter Kontrolle entsprechender Promotoren verwendet, da es einfach zu detektieren ist. Die Expression von GFP unterliegt in Hansenula polymorpha in Gegenwart hoher Konzentrationen von Glukose einer Katabolitrepression. Im batch-Modus, in dem die meisten Screenig-Ansätze durchgeführt werden, gibt es daher nur einen kurzen Zeitraum kurz vor dem vollständigen Verbrauch der Glukose, in dem GFP sekretiert werden kann. Die unter substratlimitierten Produktionsbedingungen besten Proteinproduzenten werden dabei oft nicht erkannt.

Durch Einsatz von Feed-Beads werden schon beim Screening die späteren, substratlimitierten Bedingungen sichergestellt. Die Katabolitrepression lässt sich somit umgehen und geeignete Klone werden schneller identifiziert.tl_files/kuhner/product/shaker/add-ons/GFP_499.png

Abb. 2: Hansenula polymorpha- Produktion von grün fluoreszierendem Protein (GFP) unter Einsatz von Feed-Beads (Slow-Release) und im batch Ansatz (Kontrolle); Medium SYN6 red mit 5 g/L Glukose, ohne Glyzerin, mit 100 mM Citrat, Temperatur 30 °C, Drehzahl 800rpm, Schütteldurchmesser 3mm, 96 well Mikrotiterplatte, 6 mm FeedBeads (Art.-Nr. SMFB63318)


 

Deutlich erkennbar im Kontrollansatz ohne FeedBeads ist das kurze Zeitfenster zwischen acht und zwölf Stunden Kultivierungsdauer, in dem die Hefen nach vollständigem Umsatz der Glukose GFP produzieren können, bevor ihr Stoffwechsel ohne weitere Kohlenstoffquelle zum Erliegen kommt.

In den Ansätzen mit FeedBeads ist dagegen die Proteinproduktion von Hansenula signifikant erhöht. Nach der Anwachsphase wird die vom slow-release Substrat freigesetzte Glukose sofort verbraucht. Die Zellen werden kontinuierlich mit Substrat versorgt, ohne dass eine Repression eintritt.

Durch Einsatz von Feed-Beads kann die Katabolitrepression bei Hansenula polymorpha umgangen werden.Im Vergleich zum Kontrollansatz wurde die GFP-Produktion um das vierfache gesteigert. Alle Kulturen verhalten sich synchron, die Ergebnisse sind schon in der Mikrotiterplatte reproduzierbar.

 

Escherichia coli: FeedBeads verhindern aerobe Acetatbildung

Besteht ein Ungleichgewicht zwischen Glukoseaufnahme und der Kapazität der zentralen Stoffwechselwege, bildet das Bakterium Escherichia coli in Gegenwart hoher Zuckerkonzentrationen auch unter aeroben Bedingungen das Gärungsprodukt Acetat. Dieses Nebenprodukt ist aus mehreren Gründen im Produktionsprozess unerwünscht: Die schwache organische Säure Acetat entkoppelt unter anderem den transmembranen pH-Gradienten; dies beeinträchtigt den Energiestoffwechsel  und ∆pH-abhängige Transportsysteme der Zellen. Weiterhin wird durch aerobe Acetatproduktion die effiziente Umsetzung der Glukose zum gewünschten Produkt verhindert. 

Durch Einsatz von FeedBeads wird die aerobe Acetatbildung unterbunden, indem substratlimitierte Bedingungen erzeugt werden. Die Glukosekonzentration im Medium ist nach dem Anwachsen der Zellen zu gering, um die Mechanismen des Überflussmetabolismus auszulösen. Toxische Effekte des Acetats treten nicht auf, das Substrat wird effizienter genutzt.

Die folgende Abbildung zeigt mit dem BPM-System ermittelten Verläufe von pH und Gelöstsauerstoffkonzentration einer E. coli-Kultur mit und ohne FeedBeads

tl_files/kuhner/product/shaker/add-ons/Ph-Feadbeeds_499.png

Abb. 3: Mittels BPM ermittelter Verlauf von Gelöstsauerstoffkonzentration (DO) in % und pH-Wert [- ] bei der Kultivierung von Escherichia coli im 250 mL Schüttelkolben mit und ohne FeedBeads; Minimalmedium mit 20 g/L Glukose (Kontrolle) oder 4 FeedBeads (Art.-Nr. SMFB63319); Flüssigkeitsvolumen 10 mL, Drehzahl 250 rpm, Temperatur 37 °C, Schütteldurchmesser 50 mm.

 

 

Im Kontrollansatz (gestrichelte Linien) ohne FeedBeads oxidieren die Bakterien Glukose und bilden als Nebenprodukt Acetat, erkennbar am Sinken des pH-Wertes. Nach 11 Stunden ist die  Glukose vollständig umgesetzt. Nach 15 Stunden wird der Stoffwechsel umgestellt und das gebildete Acetat als Kohlenstoffquelle genutzt, der pH-Wert steigt wieder. Nach 25 Stunden sind alle Energiequellen verbraucht, die Atmungsaktivität der Zellen nimmt in den folgenden Stunden immer mehr ab. 

Im Testansatz wird die Glukose im Medium ausschließlich von FeedBeads freigesetzt. Während der Anwachsphase der Kultur enthält das Medium für wenige Zellen eine vergleichsweise hohe Glukosekonzentration. Dies hat eine geringe Acetatbildung zu Folge, ablesbar am leichten Absinken des pH-Werts bis zu 7 h Kultivierungszeit. Zu diesem Zeitpunkt ist die Zellzahl so groß, dass Glukose zum limitierenden Faktor wird. Die Atmungsrate verringert sich, die Gelöstsauerstoffkonzentration steigt steil an. Das anfangs gebildete Acetat kann parallel zur Glukose oxidiert und somit abgebaut werden, markiert durch ein kurzes Abknicken des DO nach 8 h. Bis zum Abbruch des Versuches nach 30 h verstoffwechselt E. coli die von den FeedBeads freigesetzte Glukose ohne weitere Acetatbildung, der pH-Wert bleibt über die gesamte Kultivierungsdauer konstant. Im Gegensatz zum Kontrollansatz sinkt bei der Kultur mit dem slow-release-Substrat die Sauerstoffsättigung zu keinem Zeitpunkt unter 45 %, eine Sauerstofflimitierung tritt somit nicht ein.

Ohne apparativen Aufwand kann durch Einsatz von FeedBeads die aerobe Acetatbildung bei E. coli mit ihren unerwünschten Nebenwirkungen effektiv unterbunden und das Substrat optimal genutzt werden.