BPM-60

Produkt

Online-Messung von Gelöstsauerstoff und pH

Kurzbeschrieb

Das BPM-60 (BioProcessMonitoring) ist eine Online-Messtechnologie, bei der die Messung von Gelöstsauerstoff und pH nicht-invasiv in Erlenmeyerkolben erfolgt.

Kontinuierliche Datenaufzeichnung von Gelöstsauerstoff und pH

Die zwei wichtigen Messgrößen Gelöstsauerstoff und pH können auf einfache Weise online mit dem BPM-60 im Schüttelkolben gemessen werden. Je nach Bedarf wird nur der Parameter Gelöstsauerstoff online erfasst oder aber die beiden Parameter Gelöstsauerstoff und pH werden parallel aufgezeichnet. Das Erfassen von Gelöstsauerstoff und/oder pH-Wert kann in bis zu acht Kolben gleichzeitig stattfinden.

 

Die kontinuierliche Datenaufzeichnung bringt gegenüber der herkömmlichen Probenentnahme den Vorteil, dass sie lückenlos und automatisiert erfolgt. Die gemessenen Daten unterstützen den Anwender z.B. bei der Optimierung der Kultivierungsbedingungen im Schüttelkolben. So werden Sauerstofflimitierungen erkannt oder eine Inhibierung kann durch Auswertung von Daten festgestellt werden. Außerdem können mit dem BPM-60 reproduzierbare Vorkulturen für den Fermenter hergestellt werden (siehe PAT-Initiative der FDA).

Kein Batteriebetrieb

Eine in den Schütteltisch integrierte Buchse (Option TabCom) stellt die Stromversorgung und die Datenweiterleitung ohne Gefahr von Kabelbrüchen sicher. Für diese Technologie ist keine Batterie mehr notwendig.

Kuhner Insight Software für Datenaufzeichnung

Für die Datenaufzeichnung sorgt die Kuhner Insight Software. Zusätzlich zu den Parametern Gelöstsauerstoff und pH lassen sich mit Kuhner Insight ebenso alle Schüttelmaschinenparameter aufzeichnen, wie z.B. die Schüttelgeschwindigkeit und der CO2-Gehalt. Das Audit trail zählt zu einem weiteren Bestandteil der Software.

Technische Daten

Online-Messung von Gelöstsauerstoff und pH

BPM-60

   
Anschlüsse
+ Glasfaser (seitlich),
+ zwei für CAN-BUS (oben)
Grösse
+ Höhe: 156mm
+ Durchmesser: 84mm
+ Durchmesser Verbindungsring: 108mm
Halter + mit optischer Einheit
optische Einheit
+ Single-Version: O2,
+ Doppel-Version: O2 und pH
Kolbengrösse
+ 250, 500, 1000, 2000 mL

Kuhner Insight Software

  Überwachungssoftware, Kalibrierung und Regelung
Monitoring
8 zusätzliche Prozessparameter (8xO2 oder 4xO2 und pH)
Kalibrierung
Vorkalibrierte Sensor-Kolben
Rekalibrierung
Ein Punkt Kalibrierung möglich
Betriebssysteme
Win 7 & 10/Vista/XP
GMP
21 CFR Part 11 compliance (audit trail)

Sensor-Kolben

  Sauerstoff pH
Messbereich
0 - 100 % Sauerstoff
5.5 - 8.5 pH
Ansprechzeit
(t90) bei 25°C
30 sec
30 sec
Auflösung 0.01 % O2 bei 0.21 % O2
0.1 % O2 bei 20.9 % O2
0.01 pH bei pH=7
Genauigkeit 0.05 % O2 bei 0.2 % O2
0.4% O2 bei 20.9% O2
0.05 pH bei pH=7 mit Ein-Punkt Anpassung.
0.10 pH bei pH=7 mit Vorkalibrierung
Drift < 0.015% O2 pro Tag (bei Messintervall von 1 min) < 0.005% pH pro Tag (bei Messintervall von 1 min)
Temperaturbereich
5 - 50°C
5 - 50°C
Kompatibilität Wässrige Lösungen, Ethanol, Methanol (10% v/v), pH2-10
Wässrige Lösungen, Ethanol, Methanol (10% v/v), pH2-10
Empfindlichkeit
In der Regel keine Querempfindlichkeit in Kulturmedien
Durch Ionenstärke (Salinität) reduziert,
eine hohe Konzen-tration von kleinen im sichtbaren Bereich fluoreszierenden Molekülen kann
stören.
Lagerstabilität
18 Monate, sofern der Sensor im Dunkeln gelagert wird
18 Monate, sofern der Sensor im Dunkeln gelagert wird
Kalibrierung
Die Sensorkolben sind Vorkalibriert, eine Ein- Punkt-Kalibrierung zu Beginn des Experimentes ist bei definiertem Kultur-medium (pO2) möglich.
Die Sensorkolben sind Vorkalibriert, eine Ein-Punkt-Kalibrierung zu Beginn des Experimentes ist bei definiertem Kultur-medium (pH) möglich.
Sterilisation
Die Sensorkolben wurden mit ionisierter Strahlung sterilisiert.
Die Sensorkolben wurden mit ionisierter Strahlung sterilisiert.
erneute Sterilisation
Dampfsterilisation,
Ethylenoxid,
Gamma Bestrahlung
Wird nicht empfohlen
Technische Änderungen vorbehalten

Anwendungsbereiche

Online-Messung von Gelöstsauerstoff und pH

Saccharomyces cerevisiae: Crabtree-Effekt und Ethanolverwertung

Durch den sogenannten Überflußmetabolismus (Crabtree-Effekt) kann die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae auch in Anwesenheit von Sauerstoff Glukose zu Ethanol vergären. Nach vollständigem Verbrauch des Zuckers ist die Hefe unter aeroben Bedingungen in der Lage, den von ihr produzierten Alkohol zu oxidieren und als Energiequelle zu nutzen.

Mit Hilfe des BPM-Systems wurde der Einfluss von Schikanen auf die Sauerstoffversorgung von Hefezellen untersucht, wobei sich das oben genannte diauxische Wachstum auf Glukose und Ethanol deutlich verfolgen ließ:

 

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Abb.1: Verlauf von Gelöstsauerstoffkonzentration DO [%] und pH-Wert ­ bei Kultivierung von Saccharomyces cerevisiae im Schüttelkolben (Corning, 250 ml) mit und ohne Schikanen; YEP-Medium mit 20 g/L Glukose, 200 rpm Schüttelfrequenz, 50 mm Schütteldurchmesser, 25 mL Füllvolumen, Temperatur 37 °C.

 

 

Nach anfänglicher Abnahme der Sauerstoffkonzentration im Medium steigt diese nach 7 h wieder an und markiert den vollständigen Verbrauch des Zuckers. Neben Biomasse und CO2 entsteht dabei auch Alkohol als Nebenprodukt der aeroben Gärung.

Nachdem die Hefen ihren Stoffwechsel auf Ethanolverwertung umgestellt haben, sinkt die Gelöstsauerstoffkonzentration wieder, bis auch der Alkohol komplett oxidiert wurde. Im Schikanekolben ist dieser Punkt nach 23 h erreicht, erkennbar am sprunghaften Anstieg der Sauerstoffkonzentration. Diese sinkt während der gesamten Kultivierung im Schikanekolben nicht unter 50 % Sättigung, die Hefen wurden somit immer ausreichend belüftet. 

Im Schüttelkolben ohne Schikanen dauert der Verbrauch des anfänglich gebildeten Ethanols  dagegen länger, da nach 16 h die Sauerstoffkonzentration unter 10 % fällt und damit eine Sauerstofflimitierung der Zellen eintritt. Erst nach über 27 h sind beide Kohlenstoffquellen verbraucht und die Atmungsaktivität der Zellen vermindert sich signifikant.

In beiden Ansätzen kann nach dem jeweiligen Umsatz der Substrate (nach 23 resp. 27 h) auch ein Anstieg des pH-Wertes von 6 auf 7 beobachtet werden. Dieser ist sehr wahrscheinlich auf die Autolyse der Hefezellen zurückzuführen.

Dieses Beispiel zeigt, wie mit Hilfe des BPM Systems die Fermentationsphasen der Hefe Saccharomyces cerevisiae zeitlich eindeutig detektiert werden können, ohne aufwendiges Beproben (mit anschließender Analytik) des Schüttelkolbens.

Escherichia coli

Überflussmetabolismus und Abbau von Acetat

Im Zuge eines Ungleichgewichts zwischen Glukoseaufnahme und der Kapazität der zentralen Stoffwechselwege bildet das Bakterium Escherichia coli in Gegenwart hoher Zuckerkonzentrationen unter aeroben Bedingungen das Gärungsprodukt Acetat. Nachdem die Glukose vollständig umgesetzt wurde, kann E. coli auch das Acetat als Kohlenstoff- und Energiequelle nutzen.

Anhand der folgenden, mit dem BPM-System ermittelten Verläufe von pH und Gelöstsauerstoffkonzentration einer E. coli-Kultur lassen sich diese Phänomene online verfolgen:

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Abb.2: Verlauf von Gelöstsauerstoffkonzentration DO [%] und pH-Wert ­ bei Kultivierung von Escherichia coli im Schüttelkolben (Corning, 250 ml); Mineralmedium mit 20 g/L Glukose, 250 rpm Schüttelfrequenz, 50 mm Schütteldurchmesser, 10 mL Füllvolumen, Temperatur 37 °C.

 

 

Zu Anfang oxidieren die Bakterien unter Sauerstoffverbrauch Glukose und bilden als Nebenprodukt Acetat, erkennbar am Sinken des pH-Wertes. Nach 9 h fällt die Gelöstsauerstoffkonzentration unter 10 %, es tritt eine Sauerstofflimitierung ein.  

Nach 11 h ist die Glukose vollständig umgesetzt. Die Sauerstoffkonzentration steigt, bis die Zellen ihren Stoffwechsel auf Acetatverwertung umgestellt haben. Der Abbau des gebildeten Acetats beginnt nach 15 h, parallel erhöht sich der pH-Wert. Nach 25 Stunden sind alle Energiequellen verbraucht, die Atmungsaktivität der Zellen nimmt in den folgenden Stunden immer mehr ab.

Die Frage nach dem Zeitpunkt des vollständigen Glukoseumsatzes oder des Einstellens der zellulären Atmungsaktivität kann durch das BPM-System einfach und ohne Eingriffe in die Kultur beantwortet werden.

CHO-Zellkultur

Unterschiede zwischen Schüttelkolben mit und ohne Schikanen

Mit Hilfe des BPM wurde untersucht, ob Schüttelkolben mit oder ohne Schikanen einen Einfluss auf kultivierte CHO-Zellen haben.

 

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Abb.3: Verlauf der Gelöstsauerstoffkonzentration DO [%] bei Kultivierung von CHO-Zellen im Schüttelkolben mit und ohne Schikanen (Corning, 250 ml); Pro-CHO-Medium, 170 rpm Schüttelfrequenz, 50 mm Schütteldurchmesser, 100 mL Füllvolumen, Temperatur 37 °C, 5 % CO2 mit freundlicher Erlaubnis von ExcellGene SA (Lausanne, CH).

 

 

Im Schikanekolben liegt die Konzentration des gelösten Sauerstoffs während der gesamten Kultivierungszeit über 90 %. Im Schüttelkolben ohne Schikanen sinkt die Sauerstoffkonzentration nach drei Tagen auf 80 % Sättigung, steigt jedoch dann wieder. Mit Schikanen werden die Zellen erwartungsgemäß besser belüftet als im normalen Kolben, allerdings sind in beiden Kolben die Zellen immer ausreichend versorgt und nicht sauerstofflimitiert.

Schikanen bedeuten eine höhere mechanische Belastung der Zellen und führen auch zur Schaumbildung (siehe Abb. 4). Vermutet wurde somit ein negativer Einfluss von Schikanen auf Wachstum und Vitalität der CHO-Zellen.

 

 

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Abb. 4: CHO-Zellen kultiviert in Schüttelkolben (Corning, 250 mL), rechts mit Schikanen, links ohne.

 

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Abb.5: Verlauf von Lebendzellzahl [%] und Zelldichte [Zellen/mL] bei Kultivierung von CHO-Zellen im Schüttelkolben mit und ohne Schikanen (Corning, 250 mL); Pro-CHO-Medium, 170 rpm Schüttelfrequenz, 50 mm Schütteldurchmesser, 100 mL Füllvolumen, Temperatur 37 °C, 5 % CO2; mit freundlicher Erlaubnis von ExcellGene SA (Lausanne, CH).

 

Entgegen der Erwartungen zeigt die CHO-Zelllinie in Abbildung 5 weder bei der Lebendzellzahl noch bei den erreichten Zelldichten signifikante Unterschiede zwischen Schüttelkolben mit und ohne Schikanen.

Trotz der niedrigen Atmungsraten von tierischen Zellkulturen lässt sich mit dem BPM-System der Kultivierungsverlauf aufnehmen und  mit den offline-Daten in Übereinstimmung bringen.